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生体硫黄マップと試薬選択ガイド

生体硫黄マップと試薬選択ガイド

硫化水素 放出剤
硫化水素 定量
・ 硫化水素 蛍光
 イメージング
・ グルタチオン定量
・ サルフェン硫黄放出剤
・ サルフェン硫黄蛍光
 イメージング
・ ニトロシル化タンパク質検出
一酸化窒素(NO)放出剤
一酸化窒素(NO)消去剤

一酸化窒素(NO)定量
NO2/NO3 Assay Kit -CU
・ NO2/NO3 Assay Kit -FX
タンパク質チオール修飾解析


硫化水素の検出(定量、イメージング検出)

硫化水素の検出には従来より吸光度法であるMethylene blue法が広く使われているが、最近では蛍光プローブやモノブロモビマンを用いたHPLC法などの高感度検出法も開発されており、目的や用途に応じて選ぶことができる。また、既存のMethylene blue法は性能の面での課題が指摘されており、現在弊社で改良法の検討を行っている。

検出法
蛍光プローブ
モノブロモビマン法
Methylene blue
(メチレンブルー)法
試薬HSip-1HSip-1 DASulfide-dibimane(標準物質)
及び同位体
N,N-ジメチル-p-フェニレンジアミン硫酸
検出対象硫化水素硫化水素(細胞内)硫化水素硫化水素、結合硫黄
検出原理硫化水素と反応し発する蛍光を検出細胞膜透過後、細胞内の硫化水素と反応し発する蛍光を検出モノブロモビマンと硫化水素が反応し得られる蛍光物質(ジブロモビマン)を検出HCl存在下でN,N-ジメチル-p-フェニレンジアミン硫酸とFeCl3、硫化水素が反応し得られる青色色素(メチレンブルー)を検出
検出感度μmol/lオーダーμmol/lオーダーμmol/lオーダー
nmol/lオーダー(同位体)
μmol/lオーダー
検出アプリケーション方法蛍光検出蛍光イメージング蛍光による定量
MSによる定量(同位体)
吸光による定量
検出装置プレートリーダー蛍光顕微鏡HPLC、LC/MS(同位体)プレートリーダー、分光光度計
品コード試作品
※ 詳細はコチラをご覧ください。
SB15SB16(同位体)開発中
測定に関するご要望はコチラ


硫化水素放出剤(ドナー)

水に溶解するだけでH2Sを放出する硫化ナトリウム(Na2S)をはじめ、加水分解反応やグルタチオン/システインとの反応によりH2S発生を制御可能なドナーがあり実験目的により選択できる。

生理条件下(pH7.4)では、HS-:80%、H2S:20%の割合で理論上存在することになる。発生した硫化水素は、上記の硫化水素の検出法により検出される。

生理条件下(pH7.4)では、HS-:80%、H2S:20%の割合で理論上存在することになる。発生した硫化水素は上記の種々の手法により検出される。

Na2S
NaHS
GYY4137
H2S donor 5a
H2S donor 8l
H2S donor 8o
放出機構
-
-
加水分解反応
グルタチオンやシステインとの反応
H2S発生場所
細胞外
細胞内
放出パターン
即座
ゆっくりと持続的に
グルタチオンやシステインの濃度に依存
放出ピーク時間
-
-
数時間〜数日間持続
20分
15分
40分
品コード
-
 

サルフェン硫黄の検出(定量、イメージング)

サルフェン硫黄(Sulfane Sulfur)とは、硫黄原子のみ共有結合した硫黄の総称である。近年、サルフェン硫黄を有するポリスルフィドが脳内に存在し、脳内の神経伝達を増強することが明らかとなっている。
サルフェン硫黄の検出には一般的にシアン化物を用いた方法(Cyanolysis)が用いられるが、有毒なシアン化物を用いることや操作が煩雑などの課題がある。SSP4は新しく開発された蛍光プローブであり、サルフェン硫黄と反応して即座に蛍光を発する。
サルフェン硫黄は下記のドナーが用いられる。

検出法Cyanolysis法SSP4
検出対象サルフェン硫黄サルフェン硫黄
検出感度μmol/lオーダーμmol/lオーダー
検出方法比色蛍光
検出装置分光光度計蛍光顕微鏡、
マイクロプレートリーダー
品コード
-

SSP4によるイメージング
サルフェン硫黄ドナー(Na2S3)で処理したCHO細胞


サルフェン硫黄ドナー

多硫化ナトリウム(Na2Sn)は、汎用的なサルフェン硫黄ドナーとして使用されており、カルシウムイオンチャネルに作用して脳内の神経伝達を増強することが示されている。(右図)
サルフェン硫黄を含むパースルフィドやポリスルフィドのようなサルフェン硫黄は、システインやグルタチオンよりも還元能が非常に高く、抗酸化物質として機能している可能性も示唆されている。これらサルフェン硫黄ドナーで処理した試料を上記の検出方法により検出される。

ドナー
Sodium disulfide
(Na2S2)
Sodium trisulfide
(Na2S3)
Sodium tetrasulfide
(Na2S4)
構造
pKa1
5
4.2
3.8
pKa2
9.7
7.5
6.3
品コード

※Sodium polysulfide (Na2Sn)は、水溶液中では各pKaに応じてHydrogen polysulfide (anion)として存在する。


タンパク質チオール修飾解析検出

代表的な翻訳後修飾の一つであるタンパク質のチオール修飾は、生体内のレドックス変化に応答して生じる。チオールの翻訳後修飾によるタンパク質の機能制御を理解するためには、タンパク質中のチオールを解析し酸化還元状態を検出することが必要不可欠である。

ゲルシフトアッセイによるタンパク質チオール解析では、目的タンパク質のチオールに特定分子量の化合物を付与し、分子量の変化を電気泳動で分析し、移動幅に応じてチオール数を確認することができる。

ゲルシフトアッセイ用の試薬として、低分子ラベル化剤であるAMSやバンドシフトが大きいPEG-Malが一般的に用いられている。PEG-PCMalは、PEG-Malの課題(ウェスタンブロット時の転写効率/抗体認識の低下、バンド幅)を克服した新しい試薬である。また初めてゲルシフトアッセイ解析をされる方にも、簡便に分析できるなキットもある。

ゲルシフトアッセイ

Biotin-HPDP(WS)は、一般的に知られるBiotin-HPDPを改良した水溶性のビオチンラベル化剤であり、ニトロシル化、スルフヒドリル化、パルミトイル化などのタンパク質チオール修飾の解析法であるBiotin switch法に有用な試薬である。ビオチン化されたタンパク質は、ストレプトアビジンを用いて分離・検出することができる。

試薬
Protein Redox
Monitoring Kit Plus
PEG-PCMal
PEG-Mal
AMS
Biotin-HPDP(WS)
バンドの
シフト幅
15 kDa
5 kDa
2-20 kDa
0.5 kDa
ゲルシフトアッセイには使用しない
ウェスタン
ブロット時の
転写
×
-
バンド幅
シャープ
シャープ
分子量によって異なる
シャープ
ストレプトアビジンを用いた分離・検出
形態
キット
粉末
粉末
粉末
水溶液
品コード
-
-


S-ニトロシル化タンパク質検出

タンパク質S-ニトロシル化反応は、一酸化窒素(NO)によって起こる重要な翻訳後修飾であり、転写やタンパク質発現、シグナル伝達などの様々な細胞機能の制御に関与していることが明らかにされている。タンパク質内のS-ニトロシル基をゲルシフトアッセイにより簡便に解析可能なProtein S-Nitrosylation Monitoring Kit と、タンパク質の回収をはじめ様々なアプリケーションに応用可能なBiotin-HPDP(WS)を紹介する。

Protein S-Nitrosylation Monitoring KitBiotin-HPDP(WS)
検出原理ゲルシフトアッセイBiotin-switch 法による回収
アプリケーション電気泳動、ウエスタンブロット等ニトロシル化タンパク質の回収、
ウエスタンブロット、MS 等
チオール修飾(例:S-スルフヒドリル化)タンパク質の解析
形態キット (SH基のブロッキングからS-ニトロシル基のラベル化までに必要な試薬を含む)ビオチン化試薬(水溶液)
品コード

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