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β-ガラクトシダーゼ検出試薬(基質)の選択ガイド

β-ガラクトシダーゼ検出試薬(基質)の選択ガイド

 β-ガラクトシダーゼの検出試薬には、発色基質である5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-gal)が古くからレポーターアッセイ等において幅広く利用されている。X-galは低分子のβ-ガラクトシダーゼ酵素基質で、ガラクトース部位と5-ブロモ-4-クロロ-3-インドール部位を有しており、β-ガラクトシダーゼとの反応でガラクトースが切り離される。一方、同時に生成する5-ブロモ-4-クロロ-3-インドールは酸化されて、不溶性インジゴ色素(青色)を生じる。
 また、β-ガラクトシダーゼ検出にはX-galのような発色基質の他に蛍光基質も利用されている。Fluorescein Di-β-D-galactopyranoside(FDG)は蛍光色素であるフルオレセインをベースとした蛍光基質で、β-ガラクトシダーゼと反応すると無蛍光から緑色蛍光を発し、酵素反応後に生じるフルオレセインはX-galで生じるインジゴ色素とは異なり水に溶解する。SPiDER-βGalはFDGと同様の蛍光基質だが、細胞膜透過性が高いため生細胞に適用することができる、酵素反応後に生じた蛍光色素が近傍のタンパク質と結合するため細胞外への漏れ出しが殆どない、などの性質を有している。
 各々の検出試薬(基質)の特徴と違いを下の表に示した。

製品名
FDG
C12FDG
X-Gal
ONPG
検出方法
蛍光
蛍光
蛍光
発色
発色
基質特性
酵素反応後に蛍光を発する、かつ、近傍のタンパク質に結合する。 酵素反応によりフルオレセインを生成する。FDGよりも細胞膜への透過性を向上させている。 酵素反応後に発色すると同時に不溶性の沈殿物を生成する。酵素反応により黄色のo-ニトロフェノールを生成する。
発色・蛍光 特性
(ex/em)
493,525/560
490/514
497/518
615 nm
420 nm
主な検出方法
蛍光顕微鏡
フローサイトメーター
蛍光顕微鏡
フローサイトメーター
蛍光顕微鏡
フローサイトメーター
顕微鏡
プレートリーダー
生細胞・組織への適用
×
×
×
固定化試料への
適用
細胞内滞留性
×
×
細胞染色濃度
1 μmol/l
100 〜 2 mmol/l
33 μmol/l
2.5 mmol/l
2.3 mmol/l〜
(ELISA用として)
培養時間
15 min.
20-25 min.
20-60 min.
Overnight
N/A
酵素反応部位の数
1
2
2
1
1
特徴
生細胞膜透過性が高く、反応後の基質が細胞から漏れ出さない。試薬濃度は低くて染色でき、高感度検出が可能。最も汎用されている蛍光基質の一つ。他にもMUG、DDAOなどの蛍光基質がある。FDGは細胞膜透過性が殆ど無いため生細胞には適用できない。FDGよりも脂溶性を高めることで、生細胞への膜透過性を高めている。 古典的な基質で最も汎用されている基質。酵素反応により析出する不溶性色素を目視や装置を用いて、観察・計測する。微生物の持つβ-ガラクトシダーゼの活性測定用途で汎用されてきた基質。吸光度測定や目視による観察する。
製品コード
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 β-ガラクトシダーゼの新規蛍光基質であるSPiDER-βGalは、細胞膜透過性が高く、酵素反応後の色素が細胞外への漏れ出さない、などの特長を有していることから、組織や細胞の試料において固定化の有無に限らず、鮮明で高感度な検出ができる。以下にSPiDER-βGalを用いたアプリケーションデータに関する情報を掲載する。





アプリケーションデータを随時掲載していきます。ぜひご覧ください。


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