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SPiDER -βGAL について よくあるご質問

SPiDER -βGAL について よくあるご質問

@ X-gal染色との比較データはありますか?また、X-galに対するメリットはありますか?

A 他のβ-ガラクトシダーゼ検出用の蛍光試薬と比較して、どのようなメリットがありますか?

B 組織染色はできますか?また、どのような組織を用いた実績がありますか?

C 組織染色用のプロトコルはありますか?

D 染色後、試料の固定はできますか?

E 固定後の試料を染色したいですが可能でしょうか?

F 1キット(20 μg×3)当りの染色可能な回数の目安を教えてください。

G 細胞毒性に関する情報はありますか?

H Working solutionは、どのくらい安定ですか?

I Working solutionは、HEPES以外でも調製できますか?

J 推奨フィルターを教えてください。

Q:@ X-gal染色との比較データはありますまた、X-galに対するメリットはありますか?
A:X-galと比較して、試料を固定する必要が無く、短時間(15分間, 洗浄不要)で染色が完了するといったメリットがあります
 組織染色にて比較したデータがあります。参考論文1)の"Supporting Information" をご参考ください。

・【マウス腎臓】
 Supporting Information, Figure S14, 15. を参照ください。

・【マウス唾液腺】
 Supporting Information, Figure S14, 15. を参照ください。

・【マウス脳】
 Supporting Information, Figure S16, 17. を参照ください。

参考論文1) "Supporting Information"



Q:A 他のβ-ガラクトシダーゼ検出用の蛍光試薬と比較して、どのようなメリットがありますか?
A:
@細胞膜透過性が高い     ⇒ 短時間(15分間)、低濃度(1 μmol/l)で染色できます(動物細胞の場合)。
A試薬の漏れ出しが殆ど無い ⇒ 高感度な検出ができます。

【細胞内外における蛍光強度の時間変化の比較】
 参考論文1) "Supporting Information", Figure S7. を参照ください。
  lacZ発現HEK細胞内のSPiDER-β Galは時間経過に応じて蛍光強度が増大し、細胞外のSPiDER-β Galは増大しないことが確認され、
 SPiDER-β Galの高感度検出を支持する結果が示されています。
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Q:B 組織染色はできますか?また、どのような組織を用いた実績がありますか?
A:組織試料は、固定有り・無しに関わらず染色することができます。
  以下の組織試料を用いた実績があります。"Supporting Information" をご参考ください。

・【ショウジョウバエ組織】
  Supporting Information, Figure S9, 12, 13. を参照

・【マウス腎臓】
  Supporting Information, Figure S14, 15. を参照

・【マウス唾液腺】
  Supporting Information, Figure S14, 15. を参照

・【マウス脳】
  Supporting Information, Figure S16. を参照

参考論文1) "Supporting Information"



Q:C 組織染色用のプロトコルはありますか?
A:
ショウジョウバエ組織
ライブ染色


ショウジョウバエ幼虫からlacZ発現組織を取り出し、10-20 μmol/l SPiDER-βGalを含む培地で室温20-30分インキュベーションする。
(核を同時染色したい場合は、16 μmol/l Hoechst 33342も同時添加する。)染色後に4 % PFAで固定することも可能。

固定組織染色


ショウジョウバエ幼虫からlacZ発現組織を取り出し、4 % PFA in PBS中で20 分間インキュベーションして固定する。


PBSでかるく洗浄後、10-20 μmol/l SPiDER-βGalを含むPBS中で室温20-30分インキュベーションする。

免疫染色との併用


ショウジョウバエ幼虫からlacZ発現組織を取り出し、4 % PFA PBS中で20 分間インキュベーションして固定する。


PBS-Tで5分x3回洗浄後、ブロッキングする。


1次抗体をPBS-Tに溶解し30分インキュベーション後、PBS-Tで5分x3回洗浄する。


10 μmol/l SPiDER-βGal, 16 μmol/l Hoechst 33342, 二次抗体を含むPBS中で30分インキュベーション後、PBSで5分x3回洗浄する。

マウス組織
ライブ染色


マウスからlacZ発現組織を取り出し、適当な大きさにカットする。


10-20 μmol/l SPiDER-βGalを含むOPTI-MEM中で37 °C, 5% CO2下でインキュベーションする。
(染色後に4 % PFAで固定することも可能)

固定組織染色


マウスからlacZ発現組織を取り出し、適当な大きさにカットする。


1 % PFA, 0.2% GAを含む固定液中で固定後、10-20 μmol/l SPiDER-βGalを含むPBS中で室温60分間インキュベーションする。
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Q:D 染色後、試料の固定はできますか?
A:可能です。 SPiDER-βGalで染色した後の試料を4%パラホルムアルデヒドやメタノールで固定しても蛍光観察ができます。

【細胞染色: HEK細胞の例】
HEK細胞を用いて、1 μmol/l SPiDER-βGalのWorking solutionで室温15分インキュベーションする。
染色後に、4%PFAまたはメタノールで固定する。


【組織染色:ショウジョウバエ組織の例】
ショウジョウバエ幼虫からlacZ発現組織を取り出し、10-20 μmol/l SPiDER-βGalを含む培地で室温20-30分インキュベーションする。
(核を同時染色したい場合は、16 μmol/l Hoechst 33342も同時添加する。)染色後に4 % PFAで固定する。

【組織染色:マウス組織の例】
マウスからlacZ発現組織を取り出し、適当な大きさにカットする。
10-20 μmol/l SPiDER-βGalを含むOPTI-MEM中で37 ℃, 5% CO2下でインキュベーションする。染色後に4 % PFAで固定する。



Q:E 固定後の試料を染色したいのですが可能でしょうか?
A:可能です。 固定した試料にSPiDER-βGalで染色して蛍光観察ができます。
細胞(HEK細胞)や組織(ショウジョウバエ、マウス)を用いた例があります。
なお、固定によりβ-ガラクトシダーゼ活性は低下しますので固定化条件の検討を行ってください。

【細胞染色: HEK細胞の例】
4%PFAまたはメタノールで固定したHEK細胞を用いて、1 μmol/l SPiDER-βGalのWorking solutionで室温15分インキュベーションする。
 


【組織染色:ショウジョウバエ組織の例】
ショウジョウバエ幼虫からlacZ発現組織を取り出し、4 % PFA in PBS中で20 分間インキュベーションして固定する。
PBSでかるく洗浄後、10-20 μmol/l SPiDER-βGalを含むPBS中で室温20-30分インキュベーションする。


【組織染色:マウス組織の例】
マウスからlacZ発現組織を取り出し、適当な大きさにカットする。
1 % PFA, 0.2% GAを含む固定液中で固定後、10-20 μmol/l SPiDER-βGalを含むPBS中で室温60分間インキュベーションする。

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Q:F 1キット(20 μg×3)当りの染色可能な回数の目安を教えてください。
A:細胞染色(終濃度 1 μmol/l)の場合、使用する容器に応じて以下の量を目安にご使用いただけます。
 容器の種類
使用量の目安
  * Working solution添加
2 ml/dishで計算
200 μl/wellで計算
100 μl/wellで計算
 35 mmディッシュ
50枚
 カバーガラスチャンバー(8 wellの場合)
50個
 マイクロプレート(96 wellの場合)
10プレート



Q:G 細胞毒性に関する情報はありますか?
A:HEK細胞を用いた細胞代謝活性測定(Cell Counting Kit-8使用)によるデータがあります。

lacZ発現HEK細胞および未発現HEK細胞を用いた細胞毒性測定】
参考論文1)"Supporting Information", Figure S8. を参照ください。
種々の濃度に調製したSPiDER-β Galを細胞に暴露(37℃、炭酸ガスインキュベーターで2時間)した後、
Cell Counting Kit-8で細胞生存率が算出されています。

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Q:H Working solutionは、どのくらい安定ですか?
A:保存できません。調製した日のうちに使用してください。



Q:I Working solutionは、HBSS以外でも調製できますか?
A:PBS, Hanks' HEPESなどが使用できます。

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Q:J フローサイトメーターで使用可能ですか?
A:使用できます。β-ガラクトシダーゼ発現および未発現のHEK細胞を測り分けすることができました。

(終濃度が1μmol/lとなるようにSPiDER-βGalを加え、15分間インキューべート後に測定)





Q:K 推奨フィルターを教えてください。
A:以下のフィルターを推奨します(社内実績)。
励起蛍光
蛍光顕微鏡550/25 nm605/70 nm
フローサイトメーター(488 nm励起)530/30 nm
取扱説明書に、「励起/蛍光スペクトル」及び「上記フィルターを用いた蛍光顕微鏡測定例」を記載しています。



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