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ACE阻害活性測定をはじめる方へ 無料体験キャンペーン

ACE阻害活性測定をはじめる方へ 無料体験キャンペーン

これからACE阻害活性測定をはじめる方へ


この度、ACE Kit-WSTを多くのお客様へお使い頂きたく、
初めての方限定で「ACE Kit-WST 50tests」の無料体験キャンペーンを実施致します。
この機会にぜひお試しください。

【対象製品】

ACE Kit-WST 50 test 1セット (¥35,000.-相当) 無料 ※数量限定

【このようなお客様へお薦めします】

・食品に機能性を持たせたい
・自分のサンプルにACE阻害活性があるか評価したい
・100 tests は7万円と高く手が出せない

【応募方法】

以下のフォームよりお申込みください。
ACE阻害活性測定キットのお申込みはこちら

【キャンペーンのご応募にあたり】

お申込みは、お客様あたり(研究室あたり)1回限りとさせて頂きます。
約一か月以内にご評価頂ける方を対象とさせて頂きます。
ご応募いただいたお客様には、試供品発送の前に担当者よりご連絡させて頂きます。

わかりやすい”4ステップ測定”


目次

ステップ1 キット以外に必要な器具

ステップ2 アッセイ溶液、サンプルの調整

ステップ3 アッセイ

1 IC50の測定の場合

2 ACE阻害活性の有無の評価の場合

ステップ4 データ解析

1 IC50の測定の場合

2 ACE阻害活性の有無の評価の場合




ステップ1 キット以外に必要な器具

・プレートリーダー(450nmフィルター)・96wellマイクロプレート(50well使用)
・マイクロピペット(2-20, 20-200, 100-1000μl )・インキュベーター(37℃)
・マルチチャンネルピペット・ディスポーザブルシリンジ(1ml)

ステップ2 アッセイ溶液、サンプルの調整

<キット内容>
・Substrate buffer 1 本
・Enzyme A 1 本
・Enzyme B 1 本
・Enzyme C 1 本
・Coenzyme 1 本
・Indicator solution  1 本

<アッセイ溶液の調整>
(1) Enzyme working solutionの調整

Enzyme B 1 本に純水2 ml を加えてEnzyme B 溶液を調製する。
次にEnzyme A 1 本に、Enzyme B 溶液1.5 ml を加えて
Enzyme working solution を調製する。
※Enzyme A, B は凍結乾燥品のため瓶内部が減圧になっています。
※減圧のまま開封すると中身が飛散する恐れがありますので、
※必ず純水またはEnzyme B 溶液をシリンジで注入し、溶解後開封してください。
※必ずEnzyme B を先に純水 2 ml で溶解し、その1.5ml を用いてEnzyme A を
 溶解してください。順番を間違えると発色が低くなります。
※ Enzyme working solution は、-20℃の冷凍保存で2 週間、冷蔵保存で3 日間使用できます。

(2) Indicator working solutionの調整

Enzyme C およびCoenzyme 各1 本に純水3 ml を加えてEnzyme C 溶液およびCoenzyme 溶液を調製する。
Indicator solution に、Enzyme C 溶液とCoenzyme 溶液を2.8 ml ずつ加えてIndicator working solution を
調製する。
※Enzyme C およびCoenzyme は凍結乾燥品のため瓶内部が減圧になっています。
 減圧のまま開封すると中身が飛散する恐れがありますので、必ず純水をシリンジで注入し、
 溶解後開封してください。
※ Indicator working solution は、-20℃の冷凍保存で2 週間、冷蔵保存で3 日間使用できます。

(3) サンプル溶液の調整


・ACE阻害活性の有無を確認したい場合は、1つのサンプルにつき100μl準備してください。
・IC50を測定したい場合は、以下の例のようにサンプルを純水で希釈してください。



サンプル溶液の調整時の注意事項

・サンプル物質が水溶性でない場合、DMSO またはエタノールに溶解して
 ストック溶液を調製し、その後バッ ファーなどで希釈してください。
 その場合、DMSO またはエタノールは 1% 以下になるようにしてください。
・クエン酸や酢酸を含むサンプルなど酸性が強い場合、Substrate Buffer 中の
 基質が沈殿し、発色しなくなること があります。中和して pH 5 以上で測定してください。
・アスコルビン酸を含むサンプルは、Indicator solution を還元し、正誤差を
 与える場合があります。アスコルビン 酸は 0.01% 以下で測定してください。
・不溶性の固体物質を含むサンプルは遠沈または濾過して測定してください。
 固体物質は吸光度測定に影響します。

ステップ3 アッセイ


アッセイ-1 IC50の測定の場合



* 着色の強いサンプルの場合、 サンプルの希釈ごとにsample
 blank (sample 20 μl + 純水240 μl) を測定し、Asample から引いてください。
 特に黄色〜赤色の着色は450 nm の吸光度測定に影響します。

※プレート配置図と添加順の表をご確認ください。

1) 各ウェルにサンプル溶液(sample) もしくは純水(blank 1, blank 2) を20 μl ずつ入れる。
2) 各ウェルにSubstrate buffer を20 μl ずつ加える。
3) blank 2 のウェルに純水を20 μl ずつ加える。
4) サンプル溶液を入れたウェルとblank 1 のウェルにEnzyme working solution を20 μl ずつ加える。
* Enzyme working solution を加えるとすぐに3-Hydroxybutyric acid(3HB) の生成が始まりますので、
ウェル間のタイムラグをできるだけ少なくするためにマルチチャンネルのピペットをお使いください。
5) 37℃で60 分間インキュベートする。
6) 各ウェルにIndicator working solution を200 μl ずつ加える。
7) 室温で10 分間インキュベートする。
8) プレートリーダーで450 nm の吸光度を測定する。
9) ACE 阻害活性値( 阻害率%) を下記の計算式により求める。

    ACE 阻害活性値( 阻害率%)= [(Ablank 1 - Asample) / (Ablank 1 - Ablank 2)] x 100




アッセイ-2 ACE阻害活性の有無の評価の場合
※14サンプル測定できます



* 着色の強いサンプルの場合、 sample blank (sample 20 μl + 純水240 μl) を測定し、Asample から引いてください。
 特に黄色〜赤色の着色は450 nm の吸光度測定に影響します。



※プレート配置図と添加順の表をご確認ください。

1) 各ウェルにサンプル溶液(sample) もしくは純水(blank 1, blank 2) を20 μl ずつ入れる。
2) 各ウェルにSubstrate buffer を20 μl ずつ加える。
3) blank 2 のウェルに純水を20 μl ずつ加える。
4) サンプル溶液を入れたウェルとblank 1 のウェルにEnzyme working solution を20 μl ずつ加える。
* Enzyme working solution を加えるとすぐに3-Hydroxybutyric acid(3HB) の生成が始まりますので、
ウェル間のタイムラグをできるだけ少なくするためにマルチチャンネルのピペットをお使いください。
5) 37℃で60 分間インキュベートする。
6) 各ウェルにIndicator working solution を200 μl ずつ加える。
7) 室温で10 分間インキュベートする。
8) プレートリーダーで450 nm の吸光度を測定する。


ステップ4 データ解析

データ解析−1 IC50の測定の場合


<IC50算出>
• サンプルの濃度に対して、阻害活性値をプロットし阻害曲線を描かせる。
   ACE 阻害活性値( 阻害率%)= [(Ablank 1 - Asample) / (Ablank 1 - Ablank 2)] x 100

• 阻害率50% に相当するサンプル濃度を読む。
• 反応時のサンプルの終濃度は、調整時のサンプル濃度の 
 1/3 であるので、阻害曲線から求めた濃度の1/3 が、IC50 となる。











データ解析−2 ACE阻害活性の有無の評価の場合


<ACE阻害活性の評価>

Sampleの吸光度値(予めBlank2の吸光度を差し引く)がBlank1の吸光度値(予めBlank2の吸光度を差し引く)よりも低い場合は、
SampleにACE阻害活性があります。









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