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Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal
化学名
製品コード SG03

 容 量
    税込価格
本体価格
10
assays
\41,040
 
\38,000
【キット内容】
[10 assays: 35 mm dish]
・SPiDER-βGal ×1
・Bafilomycin A1 ×1  
 
 
 


ダウンロード

取扱説明書

プロトコル

 性 質
正常細胞は、分裂を繰り返すことや、酸化ストレス等によりDNAに損傷を生じる。損傷DNAが修復されない異常細胞がこれ以上増えないようにするため、不可逆的に分裂を停止する細胞老化が引き起こされる。このようにして生じた老化細胞において過剰発現が認められるSA-β-gal(senescence-associated β-galactosidase)は、老化マーカーの1つとして広く用いられている。代表的なSA-β-galの検出方法としてX-gal染色が広く利用されているが、(1)細胞膜透過性が乏しいため細胞を固定化する必要がある、(2)染色された細胞とそうでない細胞とを目視により見分ける必要があるため定量性に欠ける、(3)染色に時間を要する、などが課題となっている。
 本キットに含まれるβ-galactosidase検出試薬SPiDER-βGalは、細胞膜透過性が高く、優れた細胞内滞留性を有し反応後の基質が細胞外へ漏れ出さない、という性質を有し、細胞内β-galactosidaseの高感度検出、短時間染色を実現できる。また、蛍光検出が可能なことから、X-gal染色法では適用できなかったフローサイトメトリーも利用することができ、定量性のあるデータを取得できる。なお、生細胞のみならずX-gal法と同様に固定化細胞を用いてもSA-β-galを簡便かつ迅速に検出することが可能である。
原理
老化細胞を蛍光検出する原理

本キットのβ-galactosidase検出試薬SPiDER-βGalは、細胞膜透過性を有するため、特別な膜透過処理や固定化操作は不要で生細胞に適応できる。細胞膜を透過したSPiDER-βGalは、SA-β-galと反応することで蛍光を発し、かつ近傍のタンパク質と共有結合する。また、SPiDER-βGalを添加する前に本キットに含まれるBafilomycin A1を添加することで、生細胞中の内在性β-galactosidaseの活性を抑制し、バックグラウンド抑えた状態でSA-β-galを蛍光検出できる。



キットの使用手順

SA-β-Galの染色操作



特長@.生細胞も固定化細胞も適用できる

生細胞も固定化細胞も適用できる老化細胞検出
固定化細胞の場合、Bafilomycin A1を添加する必要はなく、取扱説明書に記載された手順に従うことでSA-β-galを検出できる。

※Bafilomycin A1 を添加する理由(FAQ)



特長A.定量が容易にできる

○従来法(X-gal法)では
目視による判断のため、客観的な測定が難しい。
○本キットでは
蛍光による検出なのでフローサイトメトリーによる定量解析ができる。
X-Gal法ではできないことが同仁ではできる



一般的な老化細胞マーカー

SA-β-gal
CDKis

p53 gene
SASP

DDR

(senescence-associated beta-galactosidase)
(cyclin-dependent kinase inhibitor)
ex. p16, p21 .etc

(Senescence-Associated Secretory Phenotyp)
ex. IL6, IL8 .etc
(DNA damage response)
ex. γ-H2AX, ATM, .etc

細胞老化を評価する際には、複数の老化細胞マーカーを指標に解析する必要がある。左表に示したマーカーは細胞老化研究分野で広く用いられるマーカーの一例であるが、その中でもSA-β-galは簡便に測定できることから、老化細胞の検出指標として汎用されている。


異なる老化マーカーとの共染色

a) SPiDER-βGal
b) γ-H2AX
c) DAPI
d) Merge
passage 1
passage 10
 Ex:488 nm
 Em:500-600 nm
 Ex:640 nm
 Em:640-700 nm
 Ex:405 nm
 Em:450-495 nm

ご要望が多かった本キットを用いた多重染色例をご紹介。上記実験では、老化細胞のモデルとして継代培養を繰り返したWI-38細胞(Passage 10)を用い、本キットによるSA-β-galの検出 a)、異なる老化マーカーとしてγ-H2AX(DNA損傷マーカー)の免疫染色 b)、更には全細胞の核染色(DAPI)c)を行った。
SA-β-galとγ-H2AXの両老化マーカーで相関する結果が得られた d)

※ 細胞を固定後にSA-β-gal評価および免疫染色する際は、コチラのFAQをご覧ください。
また、固定化細胞を用いた論文実績もあります。詳細は参考文献 3)をご参照ください。

(1) 継代培養を1回および10回行ったWI-38細胞を用い、本キット中の取扱説明書に記載の”生細胞を用いたアッセイ”に従いSA-β-galを染色した。
(2) 4% PFA/PBSを細胞へ添加し、室温で15分間インキュベートした。
(3) PBSで細胞を3回洗浄した。
(4) 0.1% Triton X-100/PBSを細胞へ添加し、室温で30分間インキュベートした。
(5) PBSで細胞を3回洗浄した。
(6) 1% BSA/PBSを細胞へ添加し、室温で1時間インキュベートした。
(7) 抗γ-H2AX抗体(ウサギ由来)を1% BSA/PBSにて希釈し細胞へ添加後、4℃で一晩インキュベートした。
(8) PBSで細胞を3回洗浄した。
(9) 抗ウサギ二次抗体(Alexa Fluor 647)を1% BSA/PBSにて希釈し細胞へ添加後、室温で2時間インキュベートした。
(10) PBSで細胞を3回洗浄した。
(11) PBSにて2 μg/ml に希釈したDAPI溶液[DAPI solution:コード D523]を細胞へ添加後、室温で10分インキュベートした。
(12) PBSで細胞を3回洗浄後、共焦点顕微鏡により観察した。



組織サンプル中のSA-β-gal検出

糖尿病モデルマウスの組織サンプルを用い、SPiDER-βGalによりSA-β-galを検出した論文が公開されました。
※本染色ではSPiDER-βGal[コード:SG02]が使用されています。

<組織サンプルの染色条件>
急速凍結した組織をスライス後、4%パラホルムアルデヒドに浸し20分間、室温でインキュベート。その後、PBSにて洗浄したサンプルに20 μmol/l SPiDER-βGalを加え1時間37℃でインキュベート。最後にサンプルをPBSにて洗浄し観察。

実験操作およびデータの詳細は下記参考文献の2)を参照ください。



共焦点定量イメージサイトメーターによる定量解析

共焦点定量イメージサイトメーター(横河電機株式会社 CQ1)を用いた老化細胞の定量解析を行いました。

■ 他老化マーカーと共染色と解析
SA-β-galをSPiDER-βGalで生細胞染色して細胞固定及び膜透過処理後、DNA損傷マーカー γ-H2AXを免疫蛍光染色したWI-38細胞を
用いて、共焦点定量イメージングサイトメーターで定量解析を行いました。

Young cells (P1)
Senescent cells (P10)
□ 横河電機CQ1撮影条件
使用プレート :チャンバー
対物レンズ :10倍
撮影波長 :
405 nm (DAPI):シアン
488 nm (SPiDER-βGal): 緑
640 nm (Alexa Fluor 647-抗γ-H2AX) : マゼンダ
視野 :6視野
解析領域の色 :SA-β-galポジティブなWI-38細胞

蛍光染色像

蛍光染色像

CQ1 による認識画像
CQ1 による認識画像
Young cells (P1)

Senescent cells (P10)

定量解析 – スキャッタープロット
SPiDER-βGalでSA-β-galを指標とした老化細胞の蛍光値(縦軸)と各細胞の核面積に対するγ-H2AX面積の割合(横軸)をスキャッタープロットとした定量解析を行いました。

■ 生細胞蛍光染色による解析
X-gal法では顕微鏡で目視による全細胞数と老化細胞を計測し、全細胞数に対する老化細胞数の割合を陽性率として評価します。
共焦点定量イメージングサイトメーターを用いて、核染色試薬(Hoechst 33342)で全細胞数を計測し、SPiDER-βGalでSA-β-galを指標とした老化細胞数を計測した後、全細胞数に対する老化細胞数の割合を陽性率として定量解析を行いました。

Young cells (P0)
CQ1による認識画像
Senescent cells (P13)
CQ1による認識画像
□ 横河電機CQ1撮影条件
使用プレート :96 well plate
対物レンズ :10倍
撮影波長 :405 nm (Hoechst 33342): シアン
      488 nm (SPiDER-βGal): 緑
視野 :8視野

※ SA-β-galポジティブなWI-38細胞(赤色の輪郭)
WI-38細胞の細胞分裂の程度に応じて陽性率に差が認められました。共焦点定量イメージングサイトメーターを用いることで、X-gal法による目視観察と比較して迅速な定量解析が可能となりました。





蛍光特性(β-galactosidaseと反応後のSPiDER-βGal)


<推奨フィルター>
励起:500 〜 540 nm
蛍光:530 〜 570 nm
共焦点レーザー顕微鏡およびフローサイトメーターでは、
488 nm 励起により検出した実績があります。
β-galactosidaseと反応後のSPiDER-βGalの励起・蛍光スペクトル


Q&A 
1キット当りの使用回数の目安は?
Bafilomycin A1 を添加する理由
DMSO stock solutionの安定性
Working solutionの安定性
プレート毎での使用回数の目安
蛍光観察時の注意点(リポフスチン)
固定化した細胞の検出可否
固定化細胞でのフローサイトメーター検出法
細胞を固定化後にSA-β-gal検出および免疫染色はできますか?
染色後の蛍光が確認できない又は蛍光が弱い場合の対応について
染色後の細胞固定化の可否
培地中成分(血清、フェノールレッド)の影響
老化細胞とコントロール細胞で蛍光強度に差がない場合、何を確認したら良いですか?
 
参考文献
1) T. Doura, M. Kamiya, F. Obata, Y. Yamaguchi, T. Y. Hiyama, T. Matsuda, A. Fukamizu, M. Noda, M. Miura, Y. Urano, "Detection of LacZ-Positive Cells in Living Tissue with Single-Cell Resolution.", Angew Chem Int Ed Engl., 2016, doi: 10.1002/anie.201603328
2) T. Sugizaki, S. Zhu, G. Guo, A. Matsumoto, J. Zhao, M. Endo, H. Horiguchi, J. Morinaga, Z. Tian, T. Kadomatsu, K. Miyata, H. Itoh & Y. Oike, "Treatment of diabetic mice with the SGLT2 inhibitor TA-1887 antagonizes diabetic cachexia and decreases mortality", Nature Partner Journal:Aging and Mechanisms of Disease., doi:10.1038/s41514-017-0012-0.
3) A. Park, I. Tsunoda and O. Yoshie, "Heat shock protein 27 promotes cell cycle progression by down-regulating E2F transcription factor 4 and retinoblastoma family protein p130", J. Biol. Chem.., 2018, doi: 10.1074/jbc.RA118.003310 .
 
取扱注意
1.保存方法:冷蔵
 
危険・有害性シンボルマーク(GHS表示)
 
 
備 考
 
 
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