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SPiDER-βGal
化学名 (2S,3R,4S,5R,6R)-2-{[3'-(Diethylamino)-5'-(fluoromethyl)-3H-spiro(isobenzofuran-1,9'-xanthen)-6'-yl]oxy}-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol
CAS番号 1824699-57-1
製品コード SG02

 容 量
    税込価格
本体価格
20
μgx3
\45,360
 
\42,000
 
 
 
C31H34FNO8=567.60
 


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取扱説明書

 
規格
性状:本品は赤色〜赤紫色固体でアセトニトリル及びジメチルスルホキシドに溶ける。
(2) 純度(HPLC): 90.0% 以上
(3) 蛍光スペクトル: 試験適合
(4) NMRスペクトル: 試験適合
 
取扱注意
1.保存方法:冷蔵
 
危険・有害性シンボルマーク(GHS表示)
 
 
性 質
 大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)は、レポータージーンアッセイマーカーとして幅広く用いられている。代表的なβ-ガラクトシダーゼの検出方法として、X-gal染色が広く利用されているが、細胞膜透過性が乏しいため、細胞や組織を固定化する必要がある。また、従来のβ-galactosidase検出蛍光試薬は細胞内滞留性が低いため、β-galactosidase未発現細胞と発現細胞を明瞭に区別できないことが課題であった。
 これらの課題を克服するため、浦野、神谷らは細胞膜透過性と細胞内滞留性を有する新たな蛍光試薬SPiDER-βGalの開発に成功した1)。本試薬は、β-ガラクトシダーゼとの酵素反応により、キノンメチドと呼ばれる中間体を形成して、近傍のタンパク質中のSH基等の求核性基と安定な共有結合を形成し、蛍光性になる。このように、反応した試薬が細胞内タンパク質に固定化されることで優れた細胞内滞留性を有し、その結果、β-galactosidase発現細胞を一細胞レベルで明確に検出することが可能となる。
 
原理

図1 SPiDER-βGalの細胞染色原理
SPiDER-βGal は生細胞膜を透過した後、細胞中のβ-galactosidaseによる酵素反応を受け、
その中間体はタンパク質中の求核性基と共有結合を形成することで細胞内に滞留する。



染色操作

試薬添加
染色(15分間)
観察
準備した細胞をバッファーで洗浄後、SPiDER-βGalを添加15分間インキュベート(遮光下)後、細胞をバッファーにて洗浄蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーにて蛍光観察



染色操作蛍光特性

図2 β-galactosidaseと反応後のSPiDER-βGalの励起・蛍光スペクトル



組織の蛍光イメージング

の他の詳細データ

・X-Galとの比較データ


・その他の染色データ

・組織染色用プロトコル

図3 ショウジョウバエ組織のライブイメージング
( データ提供:東京大学大学院医学系研究科 浦野泰照教授)


生細胞・固定化細胞の蛍光イメージング

図4 HEK/LacZ細胞とHEK細胞の細胞数比1:1試料のSPiDER-βGalによる染色画像
   A. 生細胞、B. 固定化細胞(4%PFA/PBS)
   (緑:SPiDER-βGal由来、青:Hoechst 33342)
HEK293 細胞およびβ- ガラクトシダーゼ安定発現HEK/LacZ 細胞を1:1 となるように混合培養し、
固定化前後でSPiDER-βGal による染色を行い共焦点顕微鏡で観察した。SPiDER-βGal の膜透
過性と細胞内滞留性により固定化前後ともに蛍光イメージングができることが確認された。



フローサイトメトリーによるβ- ガラクトシダーゼ発現細胞の検出

図5 HEK/LacZ細胞とHEK細胞のSPiDER-βGalによるフローサイトメトリーでの分別測定
HEK293 細胞およびβ- ガラクトシダーゼ安定発現HEK/LacZ細胞を1:1 となるよう混合培養し、
SPiDER-βGal による染色後にフローサイトメトリーにて測定した。SPiDER-βGal が細胞内に
滞留することにより、β-Galactosidase 安定発現株(緑色)と未発現株(灰色)を分別することが
可能となった。


            

Q&A 
SPiDER-βGalの利点について
Working solutionに使用するバッファーの種類
Working Solutionの安定性
フローサイトメーターでの使用について
固定化後の試料の染色について
推奨の励起・蛍光フィルター
染色後の試料の固定化について
組織染色について
 
参考文献
1) T. Doura, M. Kamiya, F. Obata, Y. Yamaguchi, T. Y. Hiyama, T. Matsuda, A. Fukamizu, M. Noda, M. Miura, Y. Urano, "Detection of LacZ-Positive Cells in Living Tissue with Single-Cell Resolution.", Angew Chem Int Ed Engl., 2016, doi: 10.1002/anie.201603328
2) H. Omori, S. Ogaki, D. Sakano, M. Sato, K. Umeda, N. Takeda, N. Nakagata, S. Kume, "Changes in expression of C2cd4c in pancreatic endocrine cells during pancreatic development.", FEBS Lett., 2016, doi: 10.1002/1873-3468.12271
 
備 考
 
 
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