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-SulfoBiotics- HSip-1
化学名 N-​[3',​6'-Dihydroxy-​3-​oxo-3H-spiro(isobenzofur​an-​1,​9'-​xanthen)-​5-​yl]​-​(1,​4,​7,​10-​tetraazacyclododecan​e-​1-​acetamide-​κN1,​κN4,​κN7,​κN10)​copper(2+) bis(trifluoroacetate)
CAS番号 1346220-52-7(free base)
製品コード SB21

 容 量
    税込価格
本体価格
1
mg
\21,600
 
\20,000
 
 
 
C34H33CuF6N5O10=849.19
 


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取扱説明書

 
規格
(1) 性状:本品は、褐色〜緑褐色固体である。
(2) 純度(HPLC): 90.0% 以上
(3) 性能試験: 試験適合
 
溶解
 
取扱注意
1.安衛法
 
危険・有害性シンボルマーク(GHS表示)
 
 
性 質
近年、硫化水素 (H2S)が、血管拡張や細胞保護、インスリン分泌や神経伝達調節など様々な生理活性を示すことが明らかにされ、一酸化窒素 (NO) や一酸化炭素 (CO) に続く重要なシグナル分子として注目されています。
硫化水素は、NOやCOと同様にガス状分子として認知されていますが、そのpKaは約7であり生理的pHでは約80%が硫化水素イオン (HS-)の状態で存在します。
また、硫化水素イオンは、生体内で様々な結合形態や構造をとるため、その作用機序の詳細に関して未だ不明であり、硫化水素を中心とした硫黄の生体内機能の解明が待ち望まれています。
-SulfoBiotics- HSip-1 は、硫化水素と反応し強い蛍光(λex 491 nm, λem 516 nm)を生じます。また、生体内に豊富に存在するグルタチオンやシステインとは反応せず高い硫化水素特異性を持ち、硫化水素の定量が可能です。

※ Hsip-1は、東京大学大学院薬学系研究科長野哲雄先生、花岡健二郎先生の指導の下、製品化しました。
 
測定原理

-SulfoBiotics- HSip-1 は 優れた硫化水素選択性を持つ銅(II)イオンキレート型の蛍光試薬である。
硫化水素にのみ反応し強い蛍光(λex 491 nm, λem 516 nm)を発する。


硫化水素の細胞内イメージングは、-SulfoBiotics- HSip-1 DA [コード::SB22 ] を参照ください。



硫化水素への高い選択性

HSip-1は結合型硫黄の影響を受けず、遊離の硫化水素イオンにのみ高い選択性を示す。
また蛍光強度も強いため、プレートリーダーでの定量検出が可能である。

1 μmol/l HSip-1と各活性種に対する反応性を
30 mmol/l HEPES buffer (pH 7.4) 中で37℃、30分間反応
(0) Control, (1) 10 μmol/l Na2S, (2) 10 mmol/l GSH, (3) 1 mmol/l L-Cys,
(4) 1 mmol/l DL-Hcy, (5) 1 mmol/l 2-ME, (6) 100 μmol/l DTT,
(7) 1 mmol/l NaSCN, (8) 1 mmol/l Na2SO3, (9) 1 mmol/l Na2S2O3,
(10) 10 mmol/l sodium ascorbate



既存法の課題を解決 (メチレンブルー法との比較)

サンプル中に結合型硫黄が含まれる場合、酸性条件では結合型硫黄が硫化水素となります。そのため、酸性条件下で反応を行うメチレンブルー法では、結合型硫黄に由来する硫化水素も検出・定量される(右図)。
一方、HSip-1は中性で反応を行うため、硫化水素を選択的に検出・定量することができる(左図)。

HSip-1
Na2Sを特異的に検出している
メチレンブルー法
Na2S もNa2S3も検出している
    <反応組成>
    Na2S※1/ Na2S3※2      : 100 μl
    100 μmol/l HSip-1      : 160 μl

    ※1 Na2S:硫化水素ドナー
    ※2 Na2S3:サルフェン硫黄ドナー
    <反応組成>
    Na2S※1/ Na2S3※2          : 100 μl
    1% Zinc acetate        : 120 μl
    20 mmol/l DPDA      :   20 μl
    30 mmol/l FeCl3       :   20 μl




HeLa細胞中の硫化水素検出例


1.HeLa細胞(1 x 106 cells/well)を96wellプレートに播種した。
2.炭酸ガスインキュベーターで一晩培養した。
3.ウェル中の細胞をPBS bufferで洗浄後、上清を取り除いた。
4.Lysis buffer 100 μlを添加し、ピペッティングにより細胞を溶解した。
5.HSip-1 working solution 100 μlを加え、30分、室温でインキュベートした。
6.プレートリーダーにて516 nmの蛍光強度(Ex: 491 nm)を測定した。

※ Lysis buffer組成: 6 mol/l Urea, 2% SDS, 150 mmol/l Tris-HCl (pH7.4)
※ 上記サンプルの測定に併せ硫化水素ドナー(-SulfoBiotics- Sodium Sulfide(Na2S):[コード:SB01])を用いた検量線を作成した。


硫化水素ドナーを用いた検量線

結果
得られたサンプルの蛍光強度を硫化水素の検量線にあてはめ、サンプル中の硫化水素濃度を算出した。
結果、HeLa細胞中の硫化水素濃度は3-9 μmol/lであった。



HSip-1の蛍光特性

λex : 491 nm
λem : 516 nm
<推奨フィルター>
励起:470 〜 500 nm
蛍光:500 〜 550 nm

            

Q&A 
HSip-1 stock solutionの保存
HSip-1 working solutionの保存
メチレンブルー法との違い
推奨フィルター
 
参考文献
1) K.Sasakura, K.Hanaoka, N.Shibuya, Y.Mikami, Y. Kimura, T.Komatsu, T.Ueno, T.Terai, H.Kimura, and Tetsuo Nagano, "Development of a Highly Selective Fluorescence Probe for Hydrogen Sulfide", J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, (45), 18003–18005.
2) H.Kimura, N.Shibuya, and Y.Kimura, "Hydrogen Sulfide Is a Signaling Molecule and a Cytoprotectant", Antioxid Redox Signal., 2012, 17, (1), 45-47.
3) H.Jurkowska, Heather B. Roman, Lawrence L. Hirschberger, K.Sasakura, T.Nagano, K.Hanaoka, J.Krijt, and Martha H. Stipanuk, "Primary hepatocytes from mice lacking cysteine dioxygenase show increased cysteine concentrations and higher rates of metabolism of cysteine to hydrogen sulfide and thiosulfate", Amino Acids., 2014, 48, (5), 1353-1365.
4) E.Marutani, M. Sakaguchi, W.Chen, K.Sasakura,c J. Liu, M.Xian, K. Hanaoka, T.Nagano, and F.Ichinose, "Cytoprotective effects of hydrogen sulfide-releasing N-methyl-D-aspartate receptor antagonists are mediated by intracellular sulfane sulfur", Medchemcomm., 2014, 5, (10), 1577-1583.
5) N.Fukushima, N.Ieda, M.Kawaguchi, K. Sasakura, T.Nagano, K.Hanaoka, N.Miyata, H.Nakagawa, "Development of photo-controllable hydrogen sulfide donor applicable in live cells", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters., 2015, 25, (2), 175-178.
6) E.Marutani, M.Yamada, T.Ida, K.Tokuda, K.Ikeda, S.Kai, K.Shirozu, K.Hayashida, S.Kosugi, K.Hanaoka, M.Kaneki, T.Akaike, and F.Ichinose, "Thiosulfate Mediates Cytoprotective Effects of Hydrogen Sulfide Against Neuronal Ischemia", J Am Heart Assoc., 2015, 4, (11), e002125.
7) K.Hanaoka, K.Sasakura, Y.Suwanai, S.Toma-Fukai, K.Shimamoto, Y..akano, N.Shibuya, T.Terai, T.Komatsu, T. Ueno, Y.Ogasawara, Y.Tsuchiya Y.Watanabe, H.Kimura, C.Wang, M.Uchiyama, H.Kojima, T.Okabe, Y.Urano, T.Shimizu & Tetsuo Nagano, "Discovery and Mechanistic Characterization of Selective Inhibitors of H2S-producing Enzyme: 3-Mercaptopyruvate Sulfurtransferase (3MST) Targeting Active-site Cysteine Persulfide", Scientific Reports 7., 2017, 40227, (10), 1038.
 
備 考
(開発元:Dojindo Molecular Technologies, Inc.) 
 
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