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-SulfoBiotics- PEG-PCMal
化学名
製品コード SB20

 容 量
    税込価格
本体価格
1
1
mg
mg
x10
\54,000
\8,640
 
\50,000
\8,000
 
 

SB20.jpg

 
 


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取扱説明書

 
規格
性状:本品は、微黄色〜淡黄褐色粉末又は固体である。
(2) 性能試験: 試験適合
 
取扱注意
1.保存方法:冷蔵,遮光
 
危険・有害性シンボルマーク(GHS表示)
 
 
性 質
 タンパク質のチオール基修飾は、代表的な翻訳後修飾の一つであり、生体内のレドックス変化に応答して生じる。チオール基の翻訳後修飾によるタンパク質の機能制御を理解するためには、個々のチオール基の酸化還元状態を検出することが必要不可欠となる。
 チオール基の酸化還元状態を検出する手法の一つに、チオール基と反応する高分子マレイミド試薬を用いてゲル電気泳動によるゲルシフトアッセイ法が利用されているが、この手法を用いることでタンパク質中のフリーのチオール基数を可視化することができる。高分子マレイミド試薬である-SulfoBiotics- PEG-PCMalを用いた場合、タンパク質中のチオール基数に応じた数のPEG-PCMalが結合するが、1分子のPEG-PCMalが結合することで、そのタンパク質は分子質量約5 kDa増加したバンドとして分離・検出される。
 また、従来よりPEG鎖の片方の末端にマレイミド基を有するPEG-マレイミド試薬が、上記のゲルシフトアッセイ法に用いられているが、ウエスタンブロットを行う際、PEG鎖が結合したタンパク質は結合していないタンパク質と比べて、ゲルからメンブレンへの転写効率が低くなる、また、抗体認識能が低くなる、という課題がある。-SulfoBiotics- PEG-PCMalは、PEG鎖とマレイミド基の間のリンカー内に光切断(Photo Cleavable)部位を導入した試薬で、電気泳動後のゲルにUV光を照射するとPEG鎖がラベル化されたタンパク質からPEG鎖が切り離される。これによって、このタンパク質はウエスタンブロットの操作においてPEG鎖の影響を受けることなく解析することができる。なお、本品は1 mg小分け品であることから、細胞や植物など試料に応じて試薬の使用量を設定することができる。
 
PEG-PCMalの構造

PEG-PCMalによるチオールの修飾および分離・転写イメージ

PEG鎖の片方にマレイミド基を有するPEG-PCMal(上図)は、タンパク質中のチ
オール基と結合する。PEG-PCMalでラベル化したタンパク質を電気泳動した後
、ゲルにUV光を照射するとPEG鎖がタンパク質からPEG鎖が切り離され、ウエ
スタンブロットの転写効率を損なわず解析することができる(下図)。


電気泳動によるタンパク質チオール基数の可視化

タンパク質中のチオール基数に応じた数のPEG-PCMalが結合すると、1分子のPEG-
PCMalの結合に応じて、PEG-PCMalラベル化タンパク質は分子質量が約5 kDa増加し
たバンドとして分離される。これによって、タンパク質中のチオール基数を検出すること
ができる。


測定操作

Step1
タンパク質を含む
サンプル溶液に
PEG-PCMal溶液を添加
Step2
37℃でインキュベート
(ラベル化)
Step3
ゲル電気泳動
Step4
電気泳動後のゲル
(ガラスプレート付)
にUV照射(トランス
イルミネーター)
Step5
メンブレンに転写後、抗体を用いてタンパク質を検出



実験例@ GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)のレドックス状態の解析

DTT(Dithiothreitol)で還元処理したGAPDH(36kDa、SH基数3)にPEG-PCMalを用いて、
チオール基をラベル化した後、電気泳動を行ないCBB染色で検出した。PEG-PCMalでG
APDHをラベル化することで、チオール基の数に応じたバンドが検出された。


実験例A HeLa細胞中TRX(Thioredoxin)のレドックス状態の解析

HeLa細胞に細胞溶解液で調製したPEG-PCMal溶液を加えて、細胞中のタンパク質を
ラベル化した。ラベル化後のサンプルをゲル電気泳動した後、ゲルにUV光を照射して
、ウエスタンブロット解析を行なった。
(左図: CBB染色, 右図: 抗TRX抗体を用いたウエスタンブロット)


実験例B シロイヌナズナの葉に含まれる光応答性タンパク質(ATP合成酵素γサブユニット)のレドックス状態の解析

シロイヌナズナの葉を用いてPEG-PCMalで試料中のタンパク質をラベル化して後処理
をした後、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルに光切断のためUV光を照射してウエ
スタンブロットにより解析した。汎用されている低分子ラベル化剤 AMS(4-acetamido-
4’-maleimidylstilbene-2,2’-disulfonic acid)[写真左]と比較して、PEG-PCMalで標識し
たタンパク質はバンドシフトが大きく、より分離されることを確認した[写真右]。


[技術指導]
東京工業大学科学技術創成研究院化学生命科学研究所: 久堀徹 教授, 吉田啓亮 助教
東京工業大学生命理工学院: 原怜 助教


参考文献の注釈
種々の試料中に含まれるタンパク質のチオール解析に適用される。汎用されているPEG
-Maleimideを用いた参考文献を各試料ごとに示した。
 参考文献 1): 精製タンパク質
 参考文献 2): 細胞
 参考文献 3): 組織
 参考文献 4): 菌  


Q&A 
PEG-PCMalの光安定性
DMSO溶液中での試薬の安定性
ラベル化から電気泳動の工程における遮光の必要性
検出実績のあるサンプル
光切断に使用可能な機器
 
参考文献
1) L. Makmura, M. Hamann, A. Areopagita, S. Furuta, A. Munoz and J. Momand. , "Development of a sensitive assay to detect reversibly oxidized protein cysteine sulfhydryl groups", Antioxid Redox Signal., 2001, 3, (6), 1105.
2) HH Wu, J.A. Thomas and J. Momand, "p53 protein oxidation in cultured cells in response to pyrrolidine dithiocarbamate: a novel method for relating the amount of p53 oxidation in vivo to the regulation of p53-responsive genes", Biochem J., 2000, 351, 87.
3) JR. Burgoyne, O. Oviosu and P. Eaton., "The PEG-switch assay: A fast semi-quantitative method to determine protein reversible cysteine oxidation", J Pharmacol Toxicol Methods., 2013, 68, (3), 297.
4) L. JTetsch, C. Koller, A. Donhofer and K. Jung, Detection and function of an intramolecular disulfide bond in the pH-responsive CadC of Escherichia coli", BMC Microbiol., 2011, doi: 10.1186/1471-2180-11-74.
 
備 考
(開発元:Dojindo Molecular Technologies, Inc.) 
 
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