トップページ > 商品情報:製品分類一覧 >05細胞染色用色素 > Mitophagy Detection Kit



Mitophagy Detection Kit
化学名
製品コード MD01

 容 量
    税込価格
本体価格
1
set
\38,880
 
\36,000

・Mtphagy Dye 5μg x 1
・Lyso Dye 30μg x 1
キットコンポーネントMtphagy Dye[コード:MT02]]を単品発売致しました。
 
 
 


ダウンロード

取扱説明書

プロトコル

 性 質
ミトコンドリアはエネルギー産生の場として知られ、細胞内で重要な機能を持つオルガネラの一つである。近年では、アルツハイマー病やパーキンソン病の原因の一つに不良化したミトコンドリアの蓄積が報告され、マイトファジーがその中で重要な役割をもった機構であることが明らかになってきている。マイトファジーは酸化ストレスやDNA損傷等により不良化したミトコンドリアを選択的に除去するシステムであり、不良ミトコンドリアはオートファゴソームにより隔離され、リソソームと融合し消化される。
Mtphagy Dyeは、生細胞膜を透過し細胞内のミトコンドリアに集積した後、化学結合によりミトコンドリアに固定化される。周辺の環境によりMtphagy Dyeの蛍光強度は低い状態にあるが、マイトファジーが誘導されてミトコンドリアがリソソームと融合すると、酸性条件下におかれたMtphagy Dyeの蛍光強度が増大する。本キットはマイトファジーを検出するMtphagy Dyeとリソソームを染色するLyso Dyeで構成されている。

特長
1) 低分子蛍光試薬を添加するだけでマイトファジーを簡便に検出
2) 蛍光顕微鏡による生細胞イメージングが可能
3) 付属のリソソーム染色試薬との共染色が可能
検出原理
Mtphagy Dyeによるマイトファジー検出機構

Mtphagy Dyeによるマイトファジー検出機構
本製品の測定原理・使用例が記載された論文は参考文献4)を ご覧ください。



マイトファジーの検出例

Mtphagy Dye
(マイトファジー染色)
Lyso Dye
(リソソーム染色)
MitoBright Deep Red
(ミトコンドリア染色)
重ね合せ
Parkin発現HeLa細胞(上段)および未発現HeLa細胞(下段)にCCCP(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)を添加した。Parkinを発現した細胞をCCCPで刺激することでマイトファジーを誘導し、蛍光イメージングにより検出した。また、ミトコンドリア染色色素(MitoBright Deep Red: MT08)と共染色することにより、リソソームに取り込まれたミトコンドリア(白色)と取り込まれていないミトコンドリア(紫色)を識別することが可能となった(写真: 右)。

<フィルター>
Mtphagy Dye:
561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)
Lyso Dye:
488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)
MitoBright Deep Red:
640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)


飢餓誘導条件下での検出例

Mtphagy Dye
Lyso Dye
重ね合せ
誘導条件@:
Krebs’ Buffer (Pepstatin A及びGlucagon含有)

誘導条件A:
DMEM培地 (アミノ酸不含、Pepstatin A及びE-64d含有)


<フィルター>
Mtphagy Dye:
561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)
Lyso Dye:
488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)
HeLa 細胞へMtphagy Dye を添加後、飢餓誘導条件下にて6 時間インキュベート。その後Lyso Dye 添加により
リソソームの共染色を行った結果、飢餓誘導したHeLa 細胞において、Mtphagy Dye の蛍光の増大がみられた。

マイトファジー誘導とミトコンドリア膜電位変化の検出
Parkin発現HeLa細胞を用いて、CCCP(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)添加の有無によるミトコンドリアの状態を、マイトファジー検出キット(Mitophagy Detection Kit:MD01)及びミトコンドリア膜電位検出キット(JC-1 MitoMP Detection Kit: MT09)にて評価しました。
 
結果、CCCP未処理の細胞ではマイトファジーは殆ど検出されず、またミトコンドリア膜電位が正常に維持されていることが確認されました。一方、CCCPを添加した細胞では、ミトコンドリア膜電位の低下(JC-1の赤色蛍光減少)とマイトファジーの誘導(Mtphagy Dyeの蛍光増大)を確認しました。

スケールバー:20 μm
<検出条件>
■マイトファジー検出
Ex: 561 nm, Em: 570-700 nm
■ミトコンドリア膜電位検出
Green Ex: 488 nm, Em: 500-550 nm
Red Ex: 561 nm, Em: 560-610 nm

<実験条件>
■HeLa細胞へのParkin プラスミドの導入
HilyMax(製品コード:H357)を用いてHeLa細胞へParkin プラスミドを導入(Parkin プラスミド/HilyMax reagent : 0.1 μg/0.2 μL)
し,一晩培養後の細胞を用いて下記検出を行った。
 
■マイトファジー検出
Parkin発現HeLa細胞に0.1 μmol/L Mtphagy working solution を添加し37 ℃で30分間インキュベートした。その後、細胞をHBSSにて洗浄し、10 μg/mL CCCP/MEM 溶液を添加し、37 ℃にて2時間インキュベートした。処理した細胞を、蛍光顕微鏡にて観察した。
 
■ミトコンドリア膜電位検出
Parkin発現HeLa細胞に10 μg/mL CCCP/MEM 溶液を添加し、37℃にて1.5時間インキュベートした。そこへ終濃度2 μmol/Lとなるように4 μmol/L JC-1 working solutionを添加し、37 ℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、HBSSを用いて細胞を洗浄しImaging Buffer solutionを添加後、蛍光顕微鏡にて観察した。




Mtphagy Dye, Lyso Dyeの蛍光特性

Mtphagy Dyeの
励起・蛍光スペクトル
Lyso Dyeの
励起・蛍光スペクトル


アプリケーション

 ○本製品の測定原理・使用例が記載された論文は参考文献4)を ご覧ください。
 ○フローサイトメトリーによりマイトファジーを検出した論文は参考文献1)を ご覧ください。



よくあるご質問 
Mitophagy Detection Kitの利点について
Stock solutionの安定性について
Working Solutionの安定性
フェノールレッドの影響
推奨の励起・蛍光フィルター
 
参考文献
1) J. Koniga, C. Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea and A. Hohna, "Mitochondrial contribution to lipofuscin formation", Redox Biology, 2017, 11, 673.
2) K. Kameyama, "Induction of mitophagy-mediated antitumor activity with folate-appended methyl-β-cyclodextrin", International Journal of Nanomedicine, 2017, 12, 3433.
3) E. F. Fang, T. B. Waltz, H. Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M. Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K. Marosi, M. A. Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I. G. Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A. Bohr and K. G. Becker, "Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C. elegans through mitophagy induction via the SKN-1/Nrf2 pathway", Scientific Reports, 2017, 7, (46208), DOI: 10.1038/srep46208.
4) H. Iwashita, S. Torii, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, S. Shimizu and K. Okuma, "Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule", ACS Chem. Biol., 2017, 12, (10), 2546.
5) Y. Feng, NB. Madungwe, CV. da Cruz Junho and JC. Bopassa, "Activation of G protein-coupled oestrogen receptor 1 at the onset of reperfusion protects the myocardium against ischemia/reperfusion injury by reducing mitochondrial dysfunction and mitophagy.", Br. J. Pharmacol., 2017, 174, (23), 4329.
6) K. M. Elamin, K. Motoyama, T. Higashi, Y. Yamashita, A. Tokuda and H. Arima, "Dual targeting system by supramolecular complex of folate-conjugated methyl-β-cyclodextrin with adamantane-grafted hyaluronic acid for the treatment of colorectal cancer.", Int. J. Biol. Macromol., 2018, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.02.149.
7) N. Furuya, S. Kakuta, K. Sumiyoshi, M. Ando, R. Nonaka, A. Suzuki, S. Kazuno, S. Saiki and N. Hattori, "NDP52 interacts with mitochondrial RNA poly(A) polymerase to promote mitophagy.", EMBO Rep. ., 2018, doi: 10.15252/embr.201846363.
8) L. Zhu, X. Xie, L. Zhang, H. Wang, Z. Jie, X. Zhou, J. Shi, S. Zhao, B. Zhang, X. Cheng and S. Sun, "TBK-binding protein 1 regulates IL-15-induced autophagy and NKT cell survival", Nature Communications., 2018, 9, (1), doi:10.1038/s41467-018-05097-5.
9) K. Araki, K. Kawauchi, W. Sugimoto, D. Tsuda, H. Oda, R. Yoshida and K. Ohtani, "Mitochondrial protein E2F3d, a distinctive E2F3 product, mediates hypoxia-induced mitophagy in cancer cells", Commun Biol., 2019, DOI: 10.1038/s42003-018-0246-9.
10) E. Adegoke, S. Adeniran, Y. Zeng, X. Wang, H. Wang, C. Wang, H. Zhang, P. Zheng and G. Zhang , "Pharmacological inhibition of TLR4/NF-κB with TLR4-IN-C34 attenuated microcystin-leucine arginine toxicity in bovine Sertoli cells.", J Appl Toxicol., 2019,doi: 10.1002/jat.3771.
11) E. F. Fang, Y. Hou, K. Palikaras, B. A. Adriaanse, J. S. Kerr, B. Yang, S. Lautrup, M. M. Hasan-Olive, D. Caponio, X. Dan, P. Rocktaschel, D. L. Croteau, M. Akbari, N. H. Greig, T. Fladby, H. Nilsen, M. Z. Cader, M. P. Mattson, N. Tavernarakis and V. A. Bohr, "Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer's disease.", Nat. Neurosci. ., 2019,DOI:10.1038/s41593-018-0332-9.
12).Iwasawa, T. Shinomiya, N. Ota, N. Shibata, K. Nakata, I. Shiina, and Y. Nagahara , "Novel Ridaifen-B Structure Analog Induces Apoptosis and Autophagy Depending on Pyrrolidine Side Chain", Biological and Pharmaceutical Bulletin., 2019, 42, (3), 401-410, doi: 10.1248/bpb.b18-00643.
 
規格
(1) 性状:
(2) Mtphagy Dye: 試験適合
(3) Lyso Dye: 試験適合
 
取扱注意
1.保存方法:冷蔵,遮光, 2.窒素置換,吸湿注意
 
危険・有害性シンボルマーク(GHS表示)
 
 
備 考
Mtphagy Dye およびLyso Dye は特許出願中です。
(開発元:Dojindo Molecular Technologies, Inc.) 
 
関連商品はこちらをクリックしてください。
 
05細胞染色用色素


 
ページの上部へ戻る