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DALGreen - Autophagy Detection
化学名
CAS番号 -
製品コード D675

 容 量
    税込価格
本体価格
20
nmol
\30,240
 
\28,000
 
 
 
 


ダウンロード

取扱説明書

プロトコル

 性 質
オートリソソームで見るオートファジー
DALGreenは、細胞内の不要なタンパク質・細胞小器官などの再利用や、代謝のための分解過程であるオートファジーを検出できる蛍光色素である。培養細胞に添加したDALGreenは生細胞膜を透過し、オートファジー誘導により形成されたオートファゴソーム内に取り込まる。その後、リソソームと融合し酸性環境となったオートリソソームにおいてDALGreenの蛍光が増大する。
原理



操作は試薬の添加だけ
遺伝子導入が不要。準備した細胞に試薬を添加するだけの簡単操作で蛍光イメージングを実現できます。

DALGreen
Working Solution添加
オートファジーを誘導
(30分インキュベート)
蛍光を確認
オートファジーを蛍光で確認



検出試薬の概要

蛍光顕微鏡だけでなくフローサイトメーターでも検出頂けます。またDAPGreenでは、プレートリーダーによる検出も実現しました。ご使用の装置で検出可能な蛍光特性をご確認の上、ご使用ください。
対応装置
蛍光特性
容量 / 使用回数
の目安
既存検出法
蛍光顕微鏡
フローサイト
メーター
プレート
リーダー
Ex. 425-475
Em. 500-560
※ 共焦点顕微鏡では
488 nmにて励起可能
5 nmol x 1 /
35 mm dish: 25枚分
(0.1 μmol/lで使用時)
LC3-GFP
MDC
Cyto-ID など
DALGreen
×
Ex. 350-450
Em. 500-560
※ 共焦点顕微鏡では
488 nmにて励起可能
20 nmol x 1 /
35 mm dish: 10枚分
(1.0 μmol/lで使用時)
LC3-GFP-RFP
など
※ DAPGreenとDALGreenの共染色イメージングはできません。




LC3との共染色


tagRFP-LC3発現MEF細胞へDALGreenとの共染色を行いました。結果、オートファゴソームおよびオートリソソームのマーカーであるLC3と殆ど共局在することが確認できました。(スケールバー:10 μm)

詳細は論文にて解説。
データ引用元: H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, "Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.



Lamp1との共染色


Lamp1-tagRFP発現MEF細胞へ、DALGreenとの共染色を行いました。結果、リソソーム膜タンパク質マーカーであるLamp1とDALGreenが共局在する結果が得られました。(スケールバー:10 μm)

詳細は論文にて解説。
データ引用元: H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, "Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.



ULK1/2ノックアウト細胞での評価


MEF細胞の野生株およびオートファゴソーム膜形成に関与しているULK1/2をノックアウトした株を用いてRapamycinとChloroquine刺激により比較。結果、野生株においてはDALGreenの蛍光強度の増大が確認されましたが、ULK1/2ノックアウトマウスにおいては、蛍光の増大は殆ど確認できませんでした。

詳細は論文にて解説。
データ引用元: H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, "Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.



タイムラプス動画

再生できない方は、こちらからご覧いただけます。(別画面で開きます。)

HeLa細胞をDALGreenにて染色操作後、下記条件にて培養を開始し30分間隔で
6時間までの細胞の状態を観察した。

・Nutrient Condition :増殖培地
・Autophagic Condition :アミノ酸不含培養培地

<測定条件>
装置:共焦点イメージングサイトメーター(横河電機株式会社:CQ1)
蛍光フィルター:Ex. 405 / Em. 525/50, 倍率:20X

DALGreenと既存方法の経時的な測定方法の比較
DALGreen
1つのサンプルで経時的な測定が可能

オートファジー誘導阻害前に試薬を添加するため、オートファジーをリアルタイムでモニターできる。
また、オートファジーの誘導阻害時間が不明な場合など、既存の試薬に比べて実験が楽になる。


既存試薬
測定時間毎のサンプルが必要

MDC (Monodansylcadaverine)等の既存の試薬は、オートファジー誘導後に試薬を添加するため、
測定時間ごとに細胞の準備、オートファジーの誘導/阻害、試薬の添加が必要になる。



LC3との比較

増殖培地にて培養したHeLa細胞(条件@)と飢餓培養にてオートファジーを誘導したHeLa細胞(条件A)を用いて、オートファジーマーカーであるLC3-IIの発現量とDALGreenによるイメージング像を比較した。


DALGreenによるイメージング
LC-3とDAL Greenの染色比較@
LC3-II によるウエスタンブロット解析
LC-3とDAL Greenの染色比A

結果
飢餓培養によりオートファジーを誘導したHeLa細胞においてDALGreenの蛍光強度の増大がみられた。また同様にLC3-II 発現量にも増加がみられ、双方の解析で相関する結果が得られた。

オートファジー誘導条件
@ Control : 増殖培地で6時間培養
A 飢餓誘導 : アミノ酸不含培養培地で 6時間培養

DALGreenでのイメージング条件
細胞 :Hela細胞
検出波長 :Ex. 488 nm/ Em. 500-563 nm
スケールバー :20 μm



MDCとの比較

DALGreenと既存のオートファジー検出用蛍光色素MDC(Monodansylcadaverine)を用いて、飢餓条件下で培養したHeLa細胞におけるオートファジーを検出した。

DALGreenによるイメージング

オートファジーDALGreenのイメージング濃度:1 μmol/l
インキュベート時間:30 min
検出波長:
Ex. 488 nm/ Em. 500-563 nm
スケールバー:40 μm

試薬添加後に飢餓誘導(6h)

MDCによるイメージング

MDCによるオートファジーのイメージング濃度:10 μmol/l
インキュベート時間:30 min
検出波長:
Ex. 405 nm/ Em. 450-546 nm
スケールバー:40 μm

飢餓誘導(6h)後に試薬添加

結果
DALGreen 、MDCともに飢餓誘導された細胞で蛍光強度の増大がみられた。

波長
MDCの極大励起波長は紫外域にあるため488 nmでの励起は困難だが、DALGreenでは488 nmでの励起が可能である。

操作
DALGreen :試薬添加 ⇒ 飢餓誘導
MDC   :飢餓誘導 ⇒ 試薬添加
DALGreenはオートファジー誘導前に試薬を添加するため、オートファジーをライブでモニターできる。


Q&A 
DALGreen working solutionの安定性
stock solutionの安定性について
オートファジーに関連するタンパク質をノックダウンし評価した実績はありますか?
リソソーム染色試薬との違いはありますか?
推奨の励起・蛍光フィルター
 
参考文献
1) H. Iwashita, H. T. Sakurai, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, K. Okuma, S. Shimizu, and Y. Ueno, "Small fluorescent molecules for monitoring autophagic flux", FEBS Letters., 2018, 592, (4), 559–567.
2) T. Sakata, A. Saito and H. Sugimoto, "In situ measurement of autophagy under nutrient starvation based on interfacial pH sensing", Scientific Reports., 2018, 8, 8282.
3) Y. Egawa, C. Saigo, Y. Kito, T. Moriki and T. Takeuchi , "Therapeutic potential of CPI-613 for targeting tumorous mitochondrial energy metabolism and inhibiting autophagy in clear cell sarcoma", PLoS One., 2018, 13, (6), e0198940.
 
規格
(1) 性状:本品は淡黄色固体でメタノール及びジメチルスルホキシドに溶ける。
(2) 純度(HPLC): 90.0% 以上
 
取扱注意
1.保存方法:冷凍,遮光, 2.窒素置換
 
危険・有害性シンボルマーク(GHS表示)
 
 
備 考
 
 
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