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注力製品分類

細胞アッセイ

概　要

細胞増殖アッセイや死細胞アッセイは、ドラッグスクリーニングや各種物質の毒性分析に用いられている。これらのアッセイは、酵素活性や、細胞膜の状態、細胞接着性、ATP生産量、補酵素量、ヌクレオチド取り込み活性などといった細胞機能を対象にしている。広く用いられている方法としては、Trypan Blueの死細胞と生細胞の染め分けによる細胞数計測法があるが、染色されないという条件だけでは、細胞増殖能を持った細胞と増殖能を失った細胞との区別ができない。そのため、酵素活性をベースにした細胞増殖活性測定方法が使用されるようになってきた。 　酵素活性をベースにした細胞増殖活性測定法において、MTTアッセイは、生細胞中のミトコンドリアの脱水素酵素活性をベースにした方法で、最もよく用いられている。MTTは細胞膜を透過し、ミトコンドリアに集積し、補酵素であるリボフラビンにより還元され、紫色のMTTホルマザンとなる。水溶性が低いため、MTTホルマザンは針状結晶となる。したがって吸光度を測定する前に、結晶を有機溶媒で溶解しなければならない。加えて、MTTホルマザンの結晶が析出してくることによって細胞膜が壊れ細胞が死滅してしまう。培地を除く操作では、浮遊してきた細胞を吸い込んでしまい各ウェル間のエラーが大きくなる。 　また、[3H]-チミジン取り込みアッセイは、放射性同位元素を使用しなければならないことや、試薬添加後、データ取得に数日必要であることなどの問題がある。死細胞アッセイで用いられる51Cr放出法は、高感度ではあるものの、やはり放射性同位元素を用いることが制限となる。乳酸脱水素酵素、アデニル酸リン酸化酵素、グルコース6リン酸脱水素酵素などの細胞内酵素は死細胞アッセイ用のマーカーとなるが、乳酸脱水素酵素以外は不安定である。したがって、市販されている試薬は乳酸脱水素酵素を測定するものである。 脱水素酵素を指標としたアッセイ 　小社では各種WSTを開発してきた。WSTは水溶性ホルマザンを生じるため、MTTアッセイで問題となるホルマザンの不溶化を解消できるため、細胞増殖活性測定や死細胞アッセイへの応用が可能である。WST-8は安定で、乳酸脱水素酵素の補酵素であるNADHから電子伝達物質を介して電子を受け取り還元されて高水溶性のWST-8ホルマザンとなる。Cell Counting Kit-8はWST-8と1-Methoxy PMSを含み、冷蔵保存で一年間安定である。 　使用濃度では、WST-8も1-Methoxy PMSも細胞毒性は極めて低く、Cell Counting Kit-8を用いたアッセイの後に、追加でアッセイすることも可能である。脱水素酵素を指標としたアッセイは、複数の要因が関わりあう。たとえば、脱水素酵素、NAD、NADH、ミトコンドリア活性などである。一方MTTアッセイはミトコンドリアの脱水素酵素活性のみであるので、ミトコンドリア活性を反映する。また、Cell Counting Kit-8はMTTよりも高感度に測定ができる。また、ホルマザンが水溶性であるので、溶解のプロセスが不要なため、発色後は直ちに吸光度を測定することができる。 図1　Cell Counting Kit-8の発色機構 エステラーゼ活性を指標としたアッセイ 　Cell Counting Kit-Fは細胞増殖アッセイキットであるが、これは細胞のエステラーゼ活性を指標としたものである。Calcein-AM、BCECF-AM、CFSE、FDAなどは無蛍光であるが、細胞膜を透過し、細胞内のエステラーゼで加水分解され蛍光を発するようになる。したがって、生細胞活性をエステラーゼ活性を指標として測定することができる。細胞膜を透過した後は、加水分解されて蛍光性になるが、化合物によって長時間細胞内にとどまるものと、細胞外に放出されるものがある。 死細胞生細胞同時染色 　細胞群を死んだ細胞と生きている細胞に分別する場合、生細胞は細胞に存在するエステラーゼにより細胞膜透過性のCalcein-AMが細胞内で蛍光性になるが、核酸染色試薬のPropidium iodideは細胞膜を透過できない。したがって、生細胞はCalceinの蛍光を示すことになる。一方、死細胞では膜が破壊されているため、Propidium iodideが透過できるので、核酸とインターカレートし蛍光性になる。これらの波長の異なる蛍光を観察することにより、生細胞と死細胞を分別することができる。 　　　　　　図2. HeLa細胞のCalcein-AMとPIによる二重染色　　　　 　 　　 　　　　　　　　　 　　　　　　 a) 蛍光顕微鏡像(B励起)。 　　　　　　　　　生細胞の細胞質がCalceinで緑色に、死細胞の核がPIで赤色に染色されている。 　　　　　　 b)フローサイトメーターで測定した際のサイトグラム。生細胞：緑、死細胞：赤。 細胞染色試薬 　蛍光性化合物を使って細胞を可視化する手法は、各種の細胞機能の分析に広く使用されている。細胞の活性や構造をターゲットとした蛍光性化合物が開発されてきた。最も一般的な、細胞膜、タンパクおよび核酸など、細胞構成物を染色するものである。水溶性が高くない分子量の小さい中性の分子やプラス電荷を持つ分子は細胞膜を透過することができ、分子の構造や反応性によっては細胞内に留まることができる。細胞質の染色には、細胞膜透過性で、細胞内エステラーゼで加水分解され細胞内に留まる事ができる蛍光性の分子が用いられる。また、細胞質のタンパクと反応し固定化されることで、長期間安定に細胞を蛍光染色できる。ミトコンドリアは細胞のエネルギー源としてのATPを産生する重要なコンポーネントである。一般的にミトコンドリアは電子伝達系を持っており、酸化還元性色素で染色することができる。プラス電荷を持つ分子はミトコンドリアに集積しやすい。また、核酸染色は、DNAの二重らせん部分にインターカレートし蛍光性を示す化合物や、副溝（minor groove）に結合して蛍光となる化合物が用いられる。核酸染色用試薬は、細胞膜を透過できない分子が多いので、死細胞染色に用いられる。例外的にHoechst色素は細胞膜を透過できる核酸染色剤である。 バクテリア染色 　バクテリアは核酸染色試薬や、細胞染色試薬で染色できるが、細胞膜上に存在する呼吸活性を指標にしたCTCを使って、生菌だけを染色することができる。核酸染色試薬は用いる濃度によって生菌も染色することができるため、CTCとの併用により菌染色を行うことができる。