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同仁品コード:MD01   製品名:Mitophagy Detection Kit
多重染色時の注意点を教えてください。

Mtphagy Dyeは一般的なRed系の蛍光色素に比べストークスシフトが長いため、Deep Redの蛍光色素と共染色する時には特に注意が必要です。
つまりMtphagy Dyeは500–560 nmで励起し、670-730 nmで蛍光を検出するため、Deep Redの蛍光検出波長と重なります。そのため、Deep Redの色素が励起されない波長でMtphagy Dyeを励起し、一方でMtphagy Dyeが励起されない波長でDeep Redの色素を励起する必要があります。


[漏れ込みの事例]
@ MitoBright Deep Redのみを添加した細胞(Mtphagy Dyeは添加していない条件)を用意した。
A MitoBright Deep Redの励起・蛍光波長で観察し、蛍光が観察されるかを確認した(下右図)。
B Mtphagy Dyeの励起・蛍光波長で観察し、蛍光が観察されるかを確認した(下左図)。
C BにてMitoBright Deep Red由来の蛍光が観察された(下左図)。




※上記の様に蛍光の漏れ込みが確認された場合、下記をご参照ください。

[漏れ込み時の対処法]

○励起フィルター変更による対処
 上記の確認例にある通りEx 561 nmではMitoBright Deep Redも励起されていることから、Mtphagy Dyeの励起波長をより500 nmに近いレーザーまたはフィルターに変更しMitoBright Deep Redが励起されない条件に設定する。

○励起強度および蛍光検出感度の調整による対処
 MitoBright Deep Redの蛍光がMtphagy Dyeの観察波長に漏れ込んでいる場合、蛍光が観察されないレベルまで励起強度または観察時の感度を下げる。
その後、変更したそれぞれの観察条件でMtphagy Dyeの蛍光が検出できることを確認する。



[漏れ込みの確認方法]
Mtphagy Dye、Lyso Dye(リソソーム染色試薬)、MitoBright Deep Red(ミトコンドリア染色試薬)を用いた三重染色時の確認

1. 細胞を3つのdishまたはwellに準備する。
 (Mtphagy Dye、Lyso Dye、MitoBright Deep Redは、それぞれ異なるdishまたはwell中の細胞に加え染色する)
2. Mtphagy DyeおよびMitoBright Deep Redをそれぞれの細胞に添加する。(血清不含培地中)
3. 37℃で30分間培養する。
4. マイトファジー誘導条件(飢餓培養など)にて培養する。
5. Lyso Dyeを上記2.で使用していない細胞へ添加する。(血清不含培地中)
6. 37℃で30分間培養する。
7. それぞれの試薬に滴した励起波長、蛍光波長で観察する。
8. 使用している試薬以外の観察波長で、蛍光の漏れ込みがないことを確認する。

[観察条件]
 Lyso Dye:Ex 350-450 nm、Em 500-560 nm
 Mtphagy Dye: Ex 500-560 nm、Em 670-730 nm
 MitoBright Deep Red: Ex 640 nm、Em 656-700 nm



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