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同仁品コード:S343   製品名:Spy-LHP
Spy-LHPの使用例を教えてください

チラコイド膜に埋め込まれているタンパク質複合体『PSU(光科学系U)』の過酸化脂質測定例を紹介致します。

この方法は次の文献を参考にしております。

真野純一, Sergey Khorobrykh, 尼子克己, "1.代謝産物量の定量 d.活性酸素種,抗酸化物", 低温科学, 2009, 67, 179.

1.用意するもの

 (1)Spy-LHP測定溶液:1 mmol/l Spy-LHPになるようアセトンにて溶解し、さらにエタノールで2.7 mmol/lになるよう希釈する。

   ※Spy-LHPは酸化されやすいため、溶解、希釈に用いるアセトンとエタノールはあらかじめ窒素バブリング等により

     溶存酸素量を減らしてご使用ください。またSpy-LHP溶液は用時調製にてご使用ください。

   ※一測定あたり2.7 ml使用

 (2)標準LOOH(検量線作成用):25-250 nmol/l m-chloroperbenzoic acid

2.PSU膜標品が50 μg Chl/mlの濃度となるように50 mmol/l MES-NaOH(pH6.0), 35 mol/l NaClに懸濁する。

3.光照射し、継時的に0.3 mlをとり、Spy-LHP測定溶液2.7 mlと混合する(5 μg Chl/ml)。

4.暗所で30分静置後、遠心(18,000 ×g, 5 min)により膜画分を除き、上清を励起光524nmで、535-537nmの蛍光を測定する。

5.検量線および消光補正は次のように行う。

 標準LOOH(各濃度)に、PSU膜標品を加えたもの(+PSU)と加えないもの(−PSU)を調製する。

 光照射せずに0.3 mlをSpy-LHP測定溶液2.7 mlと混合、静置、遠心し、上清を得る。

 +PSU,−PSU試料それぞれの標準LOOH濃度ゼロの蛍光強度をa1、 a2、それぞれの検量線の傾きをb1、b2とする。

 クエンチング係数はb1/b2であり、光照射後の試料の蛍光強度Xが得られたなら、それに対応するLOOH濃度は(X−a1)×b2/b1 となる。

 また、光照射前に含まれるLOOH濃度は、(a1−a2)×b2/b1となる。




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