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同仁品コード:SB12   製品名:-SulfoBiotics- Protein Redox State Monitoring Kit Plus
使用するサンプルの適切なタンパク質濃度、チオール濃度を教えてください。

タンパク質濃度として0.1〜1 mg/ml、チオール濃度として100 μmol/ml以下に合わせてください。

DTNB(製品コード:D029)を用いたチオール濃度の定量例(96 wellプレート用)は以下をご参考ください。
1. 試薬および溶液調製
・反応用バッファー(100 mmol/l sodium phosphate, pH 8.0, 1 mmol/l EDTA)

・400 μmol/l DTNB溶液
 DTNB [5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid), Code: D029] 4 mgを秤量し、反応用バッファー 1 mlで溶解する。(10 mmol/l)
上記溶液を反応用バッファーで25倍希釈する。(400 μmol/l)
 ※測定に必要なwell数×0.1 mlを調製する。下記の場合は9 wellであるため、約1 mlを調製する。

・ L-Cysteine標準液
 L-Cysteine 2.42 mgを反応用バッファー 5 mlで溶解し、4 mmol/l L-Cysteine溶液とする。
この溶液100 μlを反応用バッファー 900 μlで希釈し、400 μmol/l L-Cysteine溶液とする。この溶液を順次2倍希釈して、 L-Cysteine標準液 (200, 100, 50, 25, 12.5, 0 μmol/l)とする。

・測定試料
 サンプル(細胞溶解液やタンパク質溶液など)を反応用バッファーで希釈したものを数種類準備する。
(N=3で測定するため、350 μl以上調製する。)

2. 操作
1) 測定試料および L-Cysteine標準液を96 wellマイクロプレートの各ウェルに100 μlずつ添加する(図1)。
2) 400 μmol/l DTNB溶液100 μlを添加し、ピペッティングにより混合する。
3) 室温で15分間静置した後、マイクロプレートリーダーで412 nmにおける吸光度を測定する。
4) L-Cysteineの検量線から測定試料中のチオール濃度を算出する(図2)。
 ※サンプル希釈倍率からサンプル中のチオール濃度を計算する。


      図1.プレート配置例                                図2.L-Cysteineの検量線例




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