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同仁品コード:SG03   製品名:Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal
細胞を固定化後にSA-β-gal検出および免疫染色はできますか?

はい、染色は可能ですが、細胞を固定化するとSA-β-galが低下する可能性があります。 (下記の※2に注意事項を記載)

以下の実験例を参照しご検討ください。

WI-38細胞を固定化後に、SA-β-gal検出およびγ-H2AX(DNA損傷マーカー)の免疫染色を行った。

<実験操作>
(1) WI-38細胞を35 mm dishに播種し、37℃5% CO2インキュベーターで一晩培養した。
(2) 培養上清を除き、4% Paraformaldehyde/PBS溶液2 mlを細胞に添加し、室温で3分間インキュベートした*1
(3) PBS 2 mlで細胞を3回洗浄した。
(4) SPiDER-βGal working solution *2 2 mlを添加し、37℃で30分間インキュベートした*3
(5) PBS 2 mlで細胞を2回洗浄した。
(6) 0.1% Triton X-100/PBS 2 mlを細胞へ添加し、室温で30分間インキュベートした。
(7) PBS 2 ml2回洗浄した。
(8) 1% BSA/PBS溶液2 mlを細胞へ添加し、室温で1時間インキュベートした。
(9)γ-H2AX IgG (マウス由来)1% BSA/PBS溶液にて希釈後、細胞に添加し4℃で一晩インキュベートした。
(10) PBS 2 mlで細胞を3回洗浄した。
(11) 抗マウスIgG(Cy5標識)1% BSA/PBSで希釈後、細胞に添加し室温で1時間インキュベートした。
(12) 上清を除き、PBS 2 mlで細胞を2回洗浄し蛍光顕微鏡下で観察した。

※1 固定化時間を長くすると、SA-β-gal活性が低下します
※2 細胞の固定化操作によりSA-β-gal活性が低下する可能性があります。 もしSA-β-gal評価時に十分な蛍光強度が得られ
ない場合は、SPiDER-βGal DMSO stock solution 500-1000倍に希釈しご使用ください。通常はSPiDER-βGal DMSO
stock solutionMcIlvaine bufferpH 6.0)にて2,000倍の希釈を推奨。
  希釈倍率の異なるSPiDER-βGal working solutionの結果をFig.1に示す。
※3インキュベートの際は、5% CO2インキュベーターでは行わないこと。5% CO2インキュベーター内に固定化した細胞をおくと、
バッファーが酸性になることで内在性のβ-galactosidase活性が上昇することが考えられる。結果として、バックグラウンドが
上昇し、老化細胞と若い細胞のSA-β-gal活性の差が見えにくくなる。



<実験データ>
 
図1 免染前後におけるSPiDER-βGal染色の蛍光強度変化

免疫染色の前後でSPiDER-βGalの蛍光強度を比較すると、固定化を行う免疫染色の過程で
SPiDER-βGalの蛍光強度が低下していることを確認した。




図2 希釈倍率の異なるSPiDER-βGalによる染色例(免疫染色後)

     赤: SPiDER-βGal
     青: γ-H2AX 
     <露光時間: 1.5 sec>

SPiDER-βGal working solutionの希釈倍率を2000倍から666倍に変更することで、免疫染色(固定化)
により低下したSPiDER-βGalの蛍光強度が免疫染色前と同程度の強度を示すことを確認した。




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