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同仁品コード:A386   製品名:-Cellstain- AO
AOの使用方法を教えて下さい。

下記に一例を示します。
*細胞の種類、観察条件により濃度や固定の検討が必要です。

○HeLa細胞を用いた細胞染色
@AO 1mgを純水 1mlに溶解し、ストック溶液とする。
Aストック溶液10μlをPBS緩衝液5mlで希釈する。(AOは約6μMとなる)
BHeLa細胞をトリプシン-EDTAなどで回収し、細胞の懸濁液を準備する。
Cこの細胞懸濁液を遠心分離する。(1000rpm,3min)
 上清を除き、PBSを添加し、ピペッティングで十分分散させる。
 (この時、細胞数が10^5〜10^6 cells/mlになるように調整する)
D1.5mlマイクロチューブにCで得た細胞懸濁液30μlを添加する。
EこれにAのAO溶液15μlを添加し、37℃で15分インキュベートする。
Fカバーガラス上にEの溶液10μlをのせ、上からもう1枚カバーガラスを重ねる。
Gこのカバーガラスを蛍光顕微鏡に置き観察する。
蛍光特性:λex=502nmnm,λem=526nm(dsDNA)、λex=460nm,λem=650nm(ssDNA)

○未固定細胞のDNA-RNAの同時染色の例
 ・Z.Darynkiewicz, Methods Cell Biol.,33,285(1990)より
@Detergent溶液を調整する。保存は4℃以下で行なう。
 Triton X-100(100μl),1.0mol/l HCl(8ml),NaCl(877mg)を純水に溶解し100mlとする。
 最終濃度はそれぞれ0.1%, 0.08mol/l, 150mM となる。

A色素溶液を調整する。保存は4℃以下で行なう。
 1)100mmol/lクエン酸(37ml)と200mmol/l Na2HPO4(63ml)を混和し、100mlの溶液を作成する。
 2)NaCl(877mg)を加えて溶解する。
 3)EDTA・2Na(34mg)を加えて溶解する。
 4)AO stock solution(1mg/ml in H2O)600μlを加える。
 *最終濃度は、AO:20μM, EDTA・2Na:1mM, NaCl:150mM

B検体溶液(2x10^5 cells/ml以下)200μlにdetergent溶液400μlを加え、
 氷浴中に15秒静置する。不要な細胞の分解を防ぐ為に、検体倍地中に
 血清を10〜20%(v/v)含む方が望ましい。

C氷水で冷却した色素溶液1.2mlを加え、その後3〜15分の間に測定を行なう。

Dフローサイトメトリーで測定する。
 励起波長は488nmを使用。蛍光フィルターとして520-580nm(dsDNA),620nm(RNA,ssDNA)
 などのバンドパスフィルターを使用する。

蛍光特性:λex=502nmnm,λem=526nm(dsDNA)、λex=460nm,λem=650nm(ssDNA)



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